Quy trình kỹ thuật nhuộm Gram

Chuyên gia y tế chia sẻ quy trình kỹ thuật nhuộm Gram

Quy trình kỹ thuật nhuộm Gram hướng dẫn nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm Gram giúp phân loại vi khuẩn dựa vào hình thể, sắp xếp và tính chất bắt màu của vi sinh vật.

• Quy trình kỹ thuật nội soi trực tràng trên cận lâm sàng
• Kỹ thuật đo niệu động học là gì?
• Quy trình kỹ thuật làm tiêu bản trong chương trình đào tạo Cao đẳng Xét nghiệm

Quy trình kỹ thuật nhuộm Gram

Nguyên tắc kỹ thuật nhuộm Gram

Vi khuẩn bắt màu Gram (-) hay Gram (+) do sự khác nhau về thành phần, cấu trúc vách tế bào của vi khuẩn.

Giảng viên Cao đẳng Xét nghiệm Nguyễn Yến – Trường Cao đẳng Y dược Pasteur chia sẻ: Vi khuẩn Gram (+) có lớp peptidoglycan dầy, nhiều acid teichoic, Vi khuẩn Gram (+)  không bị ảnh hưởng bởi sự tẩy màu bằng cồn, vẫn giữ nguyên được màu tím ban đầu nếu vách tế bào không bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố như tuổi, tác dụng của thuốc kháng sinh… Vi khuẩn Gram (-) có một lớp peptidoglycan gắn với lớp phospholipid kép, xen kẽ một số protein ở màng ngoài, lớp màng này của chúng dễ bị phá hủy khi gặp cồn khi tẩy màu, do đó phức hợp tinh thể tím gentian – iod không bền, bị tẩy màu và màu được thay bởi một số thuốc nhuộm trong kỹ thuật nhuộm Gram.

Trang thiết bị, vật tư sử dụng trong kỹ thuật nhuộm Gram

Trang thiết bị

• • Tủ an toàn sinh học (ATSH) cấp 2
  • Kính hiển vi quang học.
  • Máy ly tâm
  • Máy trộn, lắc
  • Ống vô trùng có nắp đậy.
  • Đèn cồn, que cấy, lam kính, lá kính mỏng, bút viết kính, dầu soi kính, giấy thấm dầu.
  • Pipet Pasteur vô trùng.

Sinh phẩm hóa chất

• • Bộ thuốc nhuộm Gram:

+ Methanol

+ Tinh thể tím: Hucker cải tiến, tinh thể tím của Kopeloff

+ Dung dịch tẩy màu

• Nhẹ nhất: Ethanol 95%,
• Trung bình: Cồn acid
• Mạnh nhất: Aceton.

Nhuộm Gram Liên cầu khuẩn

+ Hóa chất nhuộm lần 2

• Safranin

Carbon Fuschin

• • Fuschin cơ bản
  • Safranin của Kopeloff
  • Dung dịch nước muối sinh lý vô trùng 0,9%.

Kiểm tra chất lượng kỹ thuật nhuộm Gram

• Một số hóa chất sử dụng trong y học lâm sàng để nhuộm soi phải được kiểm tra theo quy trình kiểm tra chất lượng, hóa chất, lưu lại kết quả sau khi kiểm tra.
• Cần có chủng chuẩn làm chứng:

+ Staphylococcus aureus ATCC 25923: cầu khuẩn Gram (+) sẽ bắt màu tím đậm.

+ Escherichia coli ATCC 25922: trực khuẩn Gram (-) sẽ bắt màu hồng.

An toàn trong kỹ thuật nhuộm Gram

• Thực hiện thao tác với mẫu bệnh phẩm trong tủ ATSH.
• Sử dụng một số thiết bị bảo hộ cá nhân.

Thực hiện kỹ thuật nhuộm Gram

Làm tiêu bản

• • Chuẩn bị lam kính sạch, không xước vỡ, nhúng vào dung dịch ethanol 95%.
  • Sử dụng kẹp gắp lam kính, để ráo cồn, hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn.
  • Dán nhãn hoặc ghi thông tin mẫu bệnh phẩm.
  • Sử dụng bút viết kính khoanh tròn, đánh dấu vị trí phết bệnh phẩm, mặt dưới lam kính.
  • Dàn tiêu bản theo hình xoáy trôn ốc từ trong ra ngoài hoặc hình zích zắc.
  • Đối với bệnh phẩm dịch não tủy, dịch rửa phế quản và một số dịch khác:

+ Ly tâm bệnh phẩm 3000 – 4000 rpm trong 10 phút, chắt bỏ nước nổi.

+ Sử dụng pipet Pasteur nhỏ 1 – 2 giọt bệnh phẩm lên lam kính, không dàn tiêu bản.

• Với bệnh phẩm nước tiểu: Lắc đều ống nước tiểu, lấy 10 µl bệnh phẩm phết lên lam kính, không dàn tiêu bản.
• Với bệnh phẩm từ que gòn:

+ Yêu cầu lấy 2 que gòn riêng.

+ Tình huống chỉ có một que gòn bệnh phẩm, rũ que gòn trong nước muối sinh lý hoặc canh thang vô trùng, lăn que gòn trên vùng đã đánh dấu trên lam kính.

• Một số bệnh phẩm mủ đặc:

Làm mỏng tiêu bản bằng một lam kính khác.

+ Đặt một lam kính thứ hai sạch lên lam kính đã phết tiêu bản + Kéo nhẹ nhàng lam kính thứ hai trên lam kính ban đầu.

+ Nếu tiêu bản chưa đủ mỏng, tiếp tục lặp lại với một lam kính sạch khác.

• Tình huống ít bệnh phẩm, bệnh phẩm khô, hòa loãng trong nước muối sinh lý, dàn tiêu bản.
• Bệnh phẩm mô, mảnh sinh thiết: Nghiền, cắt nhỏ bệnh phẩm, dàn tiêu bản.
• Bệnh phẩm từ môi trường nuôi cấy lỏng, nhỏ 1 – 2 giọt lên lam kính, dàn tiêu bản.
• Bệnh phẩm từ khuẩn lạc (khóm): Pha huyền dịch vi khuẩn, dàn tiêu bản.

Cố định tiêu bản

• Để tiêu bản khô tự nhiên trong tủ ATSH hoặc làm khô ở 60 độ
• Cố định tiêu bản:

+ Để lam kính lên máy sấy lam ở 60 độ C đến khi tiêu bản khô.

+ Cố định bằng nhiệt: Đưa tiêu bản ngang qua ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần, mỗi lần 5 – 10 (s).

+ Để tiêu bản nguội

+ Cố định bằng hóa chất: Nhỏ methanol phủ kín nơi dàn tiêu bản, để khô trong  1 phút, không hơ lửa.

Quy trình kỹ thuật nhuộm Gram là gì?

Phủ thuốc nhuộm

• • Phương pháp Hucker cải tiến trong kỹ thuật nhuộm Gram:

+ Nhỏ dung dịch tím Gentian, phủ kín nơi dàn đồ phiến, duy trì 1 phút. Đổ dung dịch tím gentian, rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ.

+ Nhỏ dung dịch lugol, duy trì 30 (s). Đổ dung dịch lugol, rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ.

+ Tẩy màu: Nhỏ cồn 90 độ lên tiêu bản, nghiêng đi nghiêng lại để cho cồn chảy từ cạnh nọ sang cạnh kia, khi màu tím trên lam kính vừa phai hết thì rửa nước ngay, loại bỏ hết cồn dưới vòi nước chảy nhẹ.

+ Nhỏ dung dịch đỏ fuchsin hoặc safranin hoặc carbon fuchsin lên tiêu bản, duy trì trong từ 30 (s) đến 1 phút. Đổ dung dịch, rửa dưới vòi nước chảy nhẹ.

• Phương pháp Kopeloff cải tiến trong kỹ thuật nhuộm Gram:

+ Nhỏ dung dịch tím Gentian phủ kín nơi dàn đồ phiến, sau đó thêm từ 5 giọt Na2CO3, nghiêng đi nghiêng lại tiêu bản để trộn dung dịch, duy trì 15 – 20 (s), có thể để đến 2 phút.

+ Nhỏ dung dịch I-ốt Kopeloff duy trì trong ít nhất 2 phút.

+ Nghiêng tiêu bản, tẩy màu tiêu bản bằng một số hóa chất tẩy màu, rửa tiêu bản ngay lập tức dưới vòi nước chảy.

• Làm khô tiêu bản trước khi soi kính.

Thông tin chia sẻ về quy trình kỹ thuật nhuộm Gram trong kỹ thuật xét nghiệm cơ bản, được Y sĩ đa khoa tổng hợp và chia sẻ.